Sažetak projekta

Beta-herpesvirusi opsežno reorganiziraju stanični membranski sustav, te za razliku od ostalih herpesvirusa, u citoplazmi razvijaju jedinstveni okoliš za proizvodnju virusa, poznat kao citoplazmatski odjeljak za stvaranje viriona (cVAC). Beta-herpesvirusni cVAC uglavnom je proučavan u sklopu infekcije humanim citomegalovirusom (HCMV). Istraživanja cVAC u prethodnom desetljeću temeljila su se na analizi unutarstanične raspodjele virusnih strukturnih bjelančevina (bjelančevine ovojnice viriona i tegumenta) uporabom elektronske mikroskopije (EM) i imunofluorescentnim alatima, kako bi ih kolokalizirali sa poznatim membranskim biljezima.

Ovo desetljeće obilježeno je uvođenjem novih tehnologija i sistemskih pristupa (tj. transkriptomike, proteomike, lipidomike) u staničnoj biologiji, što je rezultiralo velikim širenjem znanja o organizaciji membranskih organela i njihovoj fiziologiji. Postalo je jasno da bi postojeće znanje o biogenezi i organizaciji cVACa trebalo uskladiti s novostečenim znanjem o membranskim sustavima. U posljednjih nekoliko godina provedeno je nekoliko istraživanja temeljenih na analizi staničnog genoma tijekom infekcije citomegalovirusom (CMV). Međutim, ta istraživanja nisu dala odgovore o organizaciji i biogenezi cVAC. U skladu s nedovoljnim znanjem o cVAC, vrlo malo se zna i o procesu sekundarnog omatanja, završnoj fazi sazrijevanja CMVa koja se odvija negdje unutar cVAC, kao i o izlasku viriona.

Imunofluorescentne studije pokazale su da cVAC HCMV-a predstavlja opsežnu reorganizaciju Golgi kompleksa, ranih endosoma (EE) i reciklirajućih endosoma (RE) u veliku strukturu oko staničnog centra koja akumulira virusne strukturne bjelančevine. Nekoliko endosomalnih biljega i biljega Golgija povezano je s cVAC, te je predloženo da se mašinerija staničnog sekretornog puta koristi za omatanje i izlazak viriona.

EM studije pokazale su veliki broj tubularnih i vezikularnih struktura zajedno sa raspršenim kaspidama HCMV po cijelom cVAC te različite faze omatanja kapsida. Naša nedavna istraživanja na stanicama inficiranim mišjim CMV pokazala su da cVAC nastaje velikim preuređivanjem membranskih puteva između trans-Golgi mreže (TGN) i EE/RE (TGN-EE/RE interface) i stvaranjem potpuno nove strukture organela. Time MCMV baca potpuno novo svjetlo na staničnu fiziologiju TGN-EE/RE sučelja i otvara mogućnost boljeg razumijevanja toga slabo razjašnjenog područja. Međutim, niti jednom do sada objavljeno istraživanje nije pokazalo pojedinačno praćenje organela ili virusa kako bi se prikazalo i proučilo mjesto sekundarnog omatanja i izlaska viriona. Zbog toga su navedeni procesi slabo razjašnjeni. 

Prema našem mišljenju, postoji pet glavnih razloga koji ometaju napredak u razumijevanju procesa sklapanja i izlaska beta-herpesviriona: (i) nerazvijene metode za kvantifikaciju oslobođenih viriona; (ii) nedovoljno razvijeni pristupi za praćenje omatanja i izlaska pojedinačnih viriona; (iii) izlazak omotanog beta-herpesviriona je rijedak događaj; (iv) nedovoljno razumijevanje beta-herpesvirusnog odjeljka za sklapanje viriona koji predstavlja složenu prostornu i vremensku reorganizaciju cjelokupnog membranskog sustava stanice; (v) potreba za kombiniranjem tradicionalnih redukcionističkih i sistemsko-bioloških pristupa kako bi se razumjela biogeneza i organizacija cVAC, uključujući sekundarno omatanje i izlazak viriona. Primarna prepreka u rješavanju navedenih pitanja tijekom HCMV infekcije je nemogućnost obilježavanja pojedine virusne čestice, a time i nemogućnost kvantitativnog praćenja virusa unutar stanice kao i njegovog izlaska iz inficirane stanice.

U posljednje četiri godine, analizirali smo biogenezu i organizaciju cVAC tijekom infekcije mišjim CMV (MCMV). Koristili smo MCMV za proučavanje beta-herpesvirusne infekcije jer imamo pristup svim alatima, razvijenim kroz suradnje u posljednjih tridesetak godina. Također, MCMV u staničnoj kulturi ima kraći životni ciklus od HCMV, a rezultati istraživanja stanične biologije mogu se lako prenijeti na in vivo (životinjske) modele. Za razliku od drugih beta-herpesvirusa, biljezi (fluorescentni i HA biljezi) uspješno su ugrađeni u MCMV kapside, zato je MCMV, u ovoj fazi, jedini beta-herpesvirus kojega možemo kvantitativno pratiti u stanici i oslobođenog izvan stanice. Korištenjem navedenih alata pokušat ćemo dati neke odgovore na svih pet prethodno navedenih otvorenih pitanja u biologiji beta-herpesvirusa.

Slika 1. Stadiji u proizvodnji beta herpesvirusa u inficiranim stanicama. Proces proizvodnje je podijeljen u 7 stadija (a-j) i završava oslobađanjem infektivnih viriona iz stanice. U svakom stadiju, beta-herpesvirusi koriste odgovarajuće stanične funkcije i reorganiziraju staničnu mašineriju.

Slika 2. Organizacija MCMV viriona. Bjelančevine kapside tvore omotač koji sadrži nekoliko virusnih bjelančevina uključenih u replikaciju virusne DNA. Kapsida je okružena ovojnicom viriona koja sadrži virusni glikoprotein i čvrsto pakiran tegument.Ovojnica i tegument sadrže otprilike 25 bjelančevina podrijetlom od virusa  (dodatne bjelančevine) i varijabilan broj staničnih bjelančevina. U ovoj će se studiji pratiti virusne bjelančevine koje su prikazane obojanim prikazima. Navedene bjelančevine identificirane su masenom spektrometrijskom analizom izoliranih viriona.

Projektne aktivnosti možemo podijeliti u sedam ciljeva:

O1. Poboljšanje metoda za kvantifikaciju oslobađanja viriona.

O2. Poboljšanje metoda za praćenje sekundarnog omatanja i izlaska viriona.

O3. Otkrivanje međudjelovanja staničnih bjelančevina uključenih u sekundarno omatanje i   otkrivanje puteva izlaska viriona u stanicama inficiranim MCMV.

O4. Otkrivanje čimbenika koji su u stanici domaćinu uključeni u sekundarno omatanje i izlazak viriona.

O5. Otkrivanje odjeljka za sekundarno omatanje.

O6. Proučavanje malih odabranih GTPaza (iz Rab ili Arf porodice) za koje smo procijenili da su  ključne u procesima sekundarnog omotavanja i izlaska viriona.

O7. Izrada plana promjena koje se događaju u stanici, a neophodne su za sekundarno omatanje  i izlazak viriona.

Slika 3. Sažetak trenutnih saznanja o citoplazmatskim stadijima sazrijevanja cito-megalovirusa. Ovaj model predstavlja trenutni pogled na citoplazmatski odjeljak za stvaranje viriona (cVAC), virusne bjelančevine (glikoproteine i bjelančevine tegumenta) te dosad ispitane biljege staničnih organela. Virusne bjelančevine prikazane su plavom bojom a stanične crvenom. Kratice: DB, gusto tijelo; ER, endoplazmatski retikul; EE/RE, rani endosomi/reciklirajući endo-somi; LE, kasni endosomi; MVB, multivezularno tijelo; NIEP, neinfektivne čestice s ovojnicom.

Slika 4. Shematski prikaz značajnih pitanja koja će biti obrađena u ovoj studiji. Kapside CMV nakon izlaska iz jezgre ulaze u citoplazmatski tegument, i sekundarno omatanje se događa ili u postojećem organelu u ustaljenom stanju (B) ili intermedijeru podrijetlom iz glavnih membranskih organela (C).U oba slučaja potrebna je koncentracija virusnih glikoproteina (A) i pupanje obrnute topologije (D). Nakon omatanja, izlazak se može odvijati pomoću postojeće stanične mašinerije (E-G) i nekoliko mogućih putova izlaza (H).

 Objavljeni znanstveni radovi

1. Juric, R., Ronchieri, E., Zagorac, G., Mahmutefendic, H. and Lucin, P. (2020). Predictive Technologies and Biomedical Semantics: A Study of Endocytic Trafficking. In Proceedings of the 13th International Joint Conference on Biomedical Engineering Systems and Technologies - Volume 3 BIOINFORMATICS: BIOINFORMATICS, ISBN 978-989-758-398-8, ISSN 2184-4305, pages 260-267. DOI: 10.5220/0009375702600267
2. Karleuša Lj., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lučin P. (2020).Cytoplasmic virion assembly compartment of betaherpesviruses. Periodicum biologorum, 121–122:97–106, DOI: 10.18054/pb.v121-122i3-4.10757.
3. Lučin P., Jug Vučko N., Karleuša Lj., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lisnić B., Pavišić V., Marcelić M., Grabušić K., Brizić I., Lukanović Jurić S. (2020). Cytomegalovirus generates assembly compartment in the early phase of infection by perturbation of host-cell factors recruitment at the early endosome/endosomal recycling compartment/trans-Golgi interface. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 8:563607. DOI: 10.3389/fcell.2020.563607.
4. Malenica M., Vukomanović M., Kurtjak M., Masciotti V., dal Zilio S., Greco S., Lazzarino M., Krušić V., Perčić M., Jelovica Badovinac I., Wechtersbach K., Vidović I., Baričević V., Valić S., Lučin P., Kojc N., Grabušić K. (2021). Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines, 9(6), 603; https://doi.org/10.3390/biomedicines9060603.
5. Štimac, I.; Jug Vučko, N.; Blagojević Zagorac, G.; Marcelić, M.; Mahmutefendić Lučin, H.; Lučin, P. (2021). Dynamin Inhibitors Prevent the Establishment of the Cytomegalovirus Assembly Compartment in the Early Phase of Infection. Life 2021, 11, 876. https://doi.org/10.3390/life11090876
6. Pavišić V, Mahmutefendić Lučin H, Blagojević Zagorac G, Lučin P. (2021). Arf GTPases Are Required for the Establishment of the Pre-Assembly Compartment in the Early Phase of Cytomegalovirus Infection. Life. 2021; 11(8):867. https://doi.org/10.3390/life11080867
7. Marcelić M, Lučin HM, Begonja AJ, Zagorac GB, Lisnić VJ, Lučin P. (2021). Endosomal Phosphatidylinositol-3-Phosphate-Associated Functions Are Dispensable for Establishment of the Cytomegalovirus Pre-Assembly Compartment but Essential for the Virus Growth. Life. 2021; 11(8):859. https://doi.org/10.3390/life11080859
8. Ružić T, Lisnić VJ, Lučin HM, Roviš TL, Železnjak J, Brdovčak MC, Vrbanović A, Oreb D, Kveštak D, Jerčić KG, Borovečki F, Lučin P, Adler B, Jonjić S, Lisnić B. (2021), Characterization of M116.1p, a murine cytomegalovirus protein required for efficient infection of mononuclear phagocytes. Journal of Virology, Oct 27:JVI0087621. doi: 10.1128/JVI.00876-21. Epub ahead of print. PMID: 34705561.

Konferencijska priopćenja

1. Jurić R., Ronchieri E., Blagojević Zagorac G., Lučin P., Mahmutefendić H. (2020). Predictive Technologies and Biomedical Semantics: A Study of Endocytic Trafficking. 13th International Joint Conference on Biomedical Engineering Systems and Technologies (BIOSTEC 2020).
2. Lučin P., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G. (2020). Cellular physiology of viral infection. Covid – 19 messages I - Advancement in virology research - an opportunity to improve international impact of the University of Rijeka. The Croatian Academy of Sciences and Arts, the Department of Biomedical Sciences in Rijeka, the University of Rijeka. Rijeka, September 24, 2020 (Lučin P. - invited lecture).
3. Marcelić M., Mahmutefendić Lučin H., Jurak Begonja A., Blagojević Zagorac G., Lučin P. (2020). Endosomal PI3P domains are not required for the development of the cytomegalovirus pre-assembly compartment but are essential for efficient virion assembly. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Marcelić M. - oral presentation).
4. Šutić Udović I., Grabušić K., Blagojević Zagorac G., Mahmutefendić Lučin H., Lučin P. (2020). Quantification of the mouse cytomegalovirus by novel fluorescence signal-based approach. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Šutić Udović I. - oral presentation).
5. Štimac I., Jug Vučko N., Blagojević Zagorac G., Ruzsics Z., Lučin P., Mahmutefendić Lučin H. (2020). Remodelling of the endosomal recycling compartment interfaces with early endosomes and trans Golgi network during murine cytomegalovirus (MCMV) infection is dynamin-2 dependent. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Štimac I. - oral presentation).
6. Jug Vučko N., Karleuša Lj., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Marcelić M., Štimac I., Lučin P. (2020). Golgi apparatus redistribution and cVAC formation in the early phase of MCMV infection. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Jug Vučko N. - poster presentation).
7. Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Gulić T., Karleuša Lj., Jug Vučko N., Lučin P., Blagojević Zagorac G. (2020).Role of Arf GTPases in MCMV transport to the cell nucleus. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Pavišić V. - poster presentation).
8. Karleuša Lj., Lukanović Jurić S., Jug Vučko N., Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lisnić B., Lučin P. (2020).Cytokinesis failure in MCMV infection. The 14^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. September 25^th – 26^th, 2020 „online“ MS Teams (Karleuša Lj. - poster presentation).
9. Karleuša Lj., Lukanović Jurić S., Jug Vučko N., Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lisnić B., Lučin P. (2020). Multistep cytokinesis failure in MCMV infection.2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p24 (Karleuša Lj. - oral presentation).
10. Jenuš T., Lisnić V.J., Adler B., Mahmutefendić Lučin H., Oreb D., Vrbanović A., Lučin P., Jonjić S., Lisnić B. (2020). Molecular and functional characterization of M116 region in mouse cytomegalovirus.2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p25 (Jenuš T. - oral presentation).
11. Štimac I., Jug Vučko N., Blagojević Zagorac G., Ruzsics Z., Lučin P., Mahmutefendić Lučin H. (2020). Dynamin-2 is important for generation of viral preassembly compartment, but also for synthesis of late proteins and formation of infective virons in murine cytomegalovirus (MCMV) infection. 2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p44 (Štimac I. - poster presentation).
12. Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Gulić T., Karleuša Lj., Jug Vučko N., Lučin P., Blagojević Zagorac G. (2020).Role of ARF proteins during the early phase of MCMV infection. 2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p50 (Pavišić V. - poster presentation).
13. Jug Vučko N., Karleuša Lj., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Marcelić M., Štimac I., Lučin P. (2020).Golgi apparatus rearrangement as a first step in cVAC formation. 2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p57 (Jug Vučko N. - poster presentation).
14. Šutić I., Grabušić K., Blagojević Zagorac G., Mahmutefendić Lučin H., Lučin P. (2020). Establishing of an ELISA-like method to directly and quickly quantify virions released from mouse cytomegalovirus infected cells. 2020 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Online Only, October 1^st-2^nd 2020, Abstract book p58 (Šutić I. - poster presentation).
15. Ružić T., Juranić Lisnić V., Mahmutefendić Lučin H., Lenac Roviš T., Železnjak J., Cokarić Brdovčak M., Vrbanović A., Oreb D., Kveštak D., Gotovac Jerčić K., Borovečki F., Lučin P., Adler B., Jonjić S., Lisnić B. Characterization of m116.1p, a murine cytomegalovirus protein required for efficient infection of mononuclear phagocytes. 2021 Annual Meeting of the  Croatian Immunological Society Trogir, 23-25.09.2021. Abstract book, p19.
16. Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Gulić T., Jug Vučko N., Lučin P., Blagojević Zagorac G. MCMV induces activation and accumulation of Arf6 GTPase on membranes of virion assembly compartment. 2021 Annual Meeting of the  Croatian Immunological Society Trogir, 23-25.09.2021. Abstract book, p56.
17. Pavišić V., Mahmutefendić Lučin H., Jug Vučko N., Lučin P., Blagojević Zagorac G. Arf proteins and their GEFs are generally excluded from outer part of murine cytomegalovirus assembly compartment in the late phase of MCMV infection.The 15th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. October 7th – 8th, 2021 Zagreb. (Blagojević Zagorac, selected oral presentation).
18. Viduka I., Štimac I., Jug Vučko N., Blagojević Zagorac G., Mahmutefendić Lučin H., Lučin P. Dynamic microtubules contribute to the establishment of the cytomegalovirus assembly compartment in the early phase of infection. The 15^th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. October 7th – 8th, 2021 Zagreb. (Viduka, poster presentation).
19. Karleuša  Lj., Jug Vučko N., Pavišić V., Lukanović Jurić S., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lisnić B., Lučin P. Expansion of early endosome – endosomal recycling compartment interface initiates the establishment of the cytomegalovirus assembly compartment. The 15th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. October 7th – 8th, 2021 Zagreb.
20. Identification of the host-cell site of secondary envelopment by the analysis of linear motifs of cytomegalovirus-associated proteins. The 15th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. October 7th – 8th, 2021 Zagreb.
21. Štimac I, Blagojević Zagorac G, Lučin P, Mahmutefendić Lučin H.MCMV influence on intracellular membrane localization molecules that regulates endosomal recycling.The 15th Annual Symposium of the Croatian Physiological Society with international participation „Homeostasis – From Cell to Organ“. October 7th – 8th, 2021 Zagreb. (Štimac, poster presentation).
22. Štimac I., Marcelić M., Blagojević Zagorac G., Lučin P., Mahmutefendić Lučin H. Dynamin-2 is important for production of infective virions in murine cytomegalovirus (MCMV) infection.6^th European Congress of Immunology. September 1-4 on virtualeci2021.com.
23. Pavišić V., Jug Vučko N., Mahmutefendić Lučin H., Karleuša Lj., Lučin P., Blagojević Zagorac G. Cytomegaloviruses induce massive reorganization of Arf proteins in the early phase of infection. 6^th European Congress of Immunology. September 1-4 on virtualeci2021.com. Eur. J. Immunol. 2021. 51 (Suppl. 1): 273.
24. Karleuša Lj., Jug Vučko N., Pavišić V., Lukanović Jurić S., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Lisnić B., Lučin P.Establishment of the cytomegalovirus assembly compartment initiated by the expansion of early endosome – endosomal recycling compartment interface. 6^th European Congress of Immunology. September 1-4 on virtualeci2021.com. Eur. J. Immunol. 2021. 51 (Suppl. 1): 299.
25. Marcelić M., Mahmutefendić Lučin H., Jurak Begonja A., Blagojević Zagorac G., Lučin P. Role of the endosomal phosphatidylinositol 3‐phosphate in the biogenesis of the cytomegalovirus assembly compartment.6^th European Congress of Immunology. September 1-4 on virtualeci2021.com. Eur. J. Immunol. 2021. 51 (Suppl. 1): 300.
26. Jug Vučko N., Karleuša Lj., Mahmutefendić Lučin H., Blagojević Zagorac G., Marcelić M., Štimac I., Lučin P. cVAC formation and Golgi apparatus reorganisation in the early phase of MCMV infection.6^th European Congress of Immunology. September 1-4 on virtualeci2021.com. Eur. J. Immunol. 2021. 51 (Suppl. 1): 303.
27. Viduka I., Karleuša LJ., Lučin P. Digital holo-tomographic and confocal microscopy in cell imaging.Summer School on Image Processing, 8-17 July 2021, Rijeka.
28. Mahmutefendić Lučin H., Štimac I., Jug Vučko N., Blagojević Zagorac G., Marcelić M., Lučin P. Dynamine inhibitor(s) blocks development of cytomegalovirus assembly compartment in the early phase of infection. 45^th Annual International Herpesvirus Workshop. Virtual, August 2-6, 2021. Abstract book, p. 189.