Stanični sustav Arf GTPaza u patogenezi citomegalovirusne infekcije (Arf&CMV)

Projekt Hrvatske zaklade za znanost IP-2020-02-1323

Voditelj projekta: Prof. dr. sc. Gordana Blagojević Zagorac

Istraživački tim

Prof. dr. sc. Gordana Blagojević Zagorac, dr. med.

Doc. dr. sc. Tamara Gulić, mag. biol.

Valentino Pavišić, dr. med.

Natalia Jug Vučko,

Silvija Lukanović Jurić, dr. med.

Sažetak istraživanja

Arf proteini su male GTPaze koje putem novačenja efektorskih proteina organiziraju stanični citoskelet i mijenjaju dinamiku membrana te tako reguliraju promet unutar sekretornog i endocitoznog sustava, staničnu diobu i migraciju. Arf proteini su na temelju međusobne podudarnosti njihovih sekvenci podijeljeni u tri razreda. Razredu I pripadaju Arf1, Arf2 i Arf3, razredu II Arf4 i Arf5, dok je Arf6 jedini predstavnik razreda III. Baš poput drugih malih GTPaza i Arf proteini funkcioniraju kao molekulske sklopke jer kruže između svog inaktivnog (onaj koji veže GDP) i aktivnog (onaj koji veže GTP) oblika. Inaktivirani Arf proteini su pretežito difuzno raspršeni u citoplazmi, a aktiviraju se na staničnim membranama na mjestima gdje se nalaze faktori izmjene gvanin nukleotida (GEF). GEF proteini posreduju zamjenu GDPa za GTP, što izaziva konformacijske promjene Arf proteina i ima za posljedicu njihovo čvrsto vezivanje za membrane te novačenje efektorskih molekula koje se nalaze u neposrednoj blizini. Endogena GTPazna aktivnost Arf proteina je izrazito mala i stoga su za njihovu inaktivaciju potrebni GAP proteini koji potičući hidrolizu GTPa dovode do njihove inaktivacije. Nakon hidrolize GTPa Arf1 i Arf3 se otpuštaju sa membrana, dok Arf4, Arf5 i Arf6 u nekim slučajevima mogu i dalje ostati vezani za membranu. 

Citomegalovirusi (CMV) su široko rasprostranjeni DNA virusi iz obitelji herpesvirusa koji nakon akutne, uglavnom asimptomatske infekcije, ulaze u latentnu fazu iz koje se u bilo kojem trenutku mogu ponovno aktivirati te kod imunokompromitiranih osoba dovesti do životno ugrožavajućih stanja. Već tijekom rane faze CMV infekcije dolazi do masivne reorganizacije staničnih funkcija, uključujući i reorganizaciju membranskih odjeljaka i staničnog citoskeleta što u konačnici rezultira stvaranjem citoplazmatskog odjeljka za sklapanje viriona (cVACa). cVAC je veliki, cilindrični, jukstanuklearno smješten odjeljak koji ima fenotipske karakteristike mnogih unutarstaničnih odjeljaka, uključujući rane endosome, reciklirajuće endosome i trans-Golgijevu mrežu (TGN). Iako je funkcija Arf proteina ispitivana u patogenezi mnogih bakterijskih i virusnih infekcija te je poznato da je aktivacija Arf1 i Arf6 proteina važan faktor virulencije bakterija L. pneumophila, R. prowazekii i bakterija iz roda Salmonellate jednolančanih RNA virusapoput Hepatitis C virusa, koronavirusa i virusa HIVa, o ulozi Arf proteina u CMV infekciji vrlo se malo zna. Za razliku od ostalih patogena koji samo koriste staničnu mašineriju za odvijanje vlastitog životnog ciklusa, karakteristika herpesvirusa je ekstenzivno preuređivanje organela stanica domaćina te u nekim slučajevima čak i formiranje novih odjeljaka, što je upravo karakteristika CMVa. Stoga je logično očekivati da će upravo Arf proteini biti važan faktor virulencije citomegalovirusa, odnosno cijele porodice herpesvirusa.

Ovo istraživanje uvelike bi doprinijelo razumijevanju uloge Arf proteina u replikacijskom ciklusu CMVa, odnosno ovim istraživanjem utvrdilo bi se da li su Arf proteini potrebni za ulazak virusa u stanicu, njegovu replikaciju i stvaranje cVACa. Nadalje, kroz analizu najvažnijih Arf GEF i Arf GAP proteina koji dolaze u interakciju s Arf proteinima tijekom CMV infekcije, a koji su odgovorni za njihovu aktivaciju/inaktivaciju, dobile bi se nova saznanja o specifičnosti i lokalizaciji Arf-regulatornih proteina koja bi mogla vrijediti i za neinficirane stanice. Nadalje, veliki iskorak ovog istraživanja bilo bi utvrđivanje genske regije virusa, odgovorne za reorganizaciju Arf sustava stanica domaćina tijekom CMV infekcije. Razumijevanjem mehanizama kojim CMV dovodi do reorganizacije endosomalnog sustava stanica domaćina, a što za posljedicu ima izbjegavanje imunološkog odgovora te neometanu replikaciju virusa, stvorila bi se platforma za razvoj novih antivirusnih lijekova.

Postignuća

Publikacije

1. Pavišić V, Mahmutefendić Lučin H, Blagojević Zagorac G, Lučin P. Arf GTPases Are Required for the Establishment of the Pre-Assembly Compartment in the Early Phase of Cytomegalovirus Infection. Life (Basel). 2021 Aug 23;11(8):867. doi: 10.3390/life11080867. PMID: 34440611; PMCID: PMC8399710.

Kongresna priopćenja

1. Valentino Pavišić, Natalia Jug Vučko, Hana Mahmutefendić Lučin, Ljerka Karleuša, Pero Lučin, Gordana Blagojević Zagorac. Cytomegaloviruses induce massive reorganization of Arf proteins in theearly phase of infection. Abstracts of ECI 2021; 6th European Congress of Immunology. 1‐4 September 2021. Virtual meeting. (European Journal of Immunology Volume 51, Suppl. 1, August 2021)
2. Valentino Pavišić, Hana Mahmutefendić Lučin, Tamara Gulić, Natalia Jug Vučko, Pero Lučin1,2 and Gordana Blagojević Zagorac. MCMV induces activation and accumulation of Arf6 GTPase on membranes of virion assembly compartment. 2021 Annual Meeting of the Croatian Immunological Society, Trogir, 23.-25.09.2021.
3. Valentino Pavišić, Hana Mahmutefendić Lučin, Natalia Jug Vučko, Pero Lučin, Gordana Blagojević Zagorac. Arf proteins and their GEFs are generally excluded from outer part of murine cytomegalovirus assembly compartment in the late phase of MCMV infection15^thAnnual Meeting of Croatian Physiological Society with lnternational Participation, Zagreb 07-08.10.2021.
4. Valentino Pavišić, Hana Mahmutefendić Lučin, Pero Lučin, Gordana Blagojević Zagorac. Arf proteins accumulate in the citomegalovirus assembly compartment during the early phase of infection. The 45th FEBS Virtual Congress. 3-8 July 2021. Virtual meeting.